狗狗抗体检查通常采用ELISA方法，即用狗狗血清与目标病原体反应，然后用特定标记物检测抗体与病原体结合情况。这种方法简便、快捷、准确，可以检测多种病原体，例如犬瘟热、狂犬病等。同时，也可以通过血凝试验或中和试验来检测狗狗体内的抗体水平。检测出的抗体水平可作为狗狗是否免疫的参考，以及是否需要进行疫苗加强针的依据。

病原学和实验室诊断

（一）病原学

狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）属于单负病毒（Mononegavirales）弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病毒属（Lyssavirus）[1]。狂犬病病毒颗粒呈 *** 状，长100-300nm，直径约75nm。病毒基因组长约12kb，为不分节段的单股负链RNA，从3’到5’端依次编码5 种结构蛋白，分别为 *** （Nucleoprotein, N）、磷蛋白（Phosphoprotein, P）、基质蛋白（Matrixprotein, M）、糖蛋白（Glycoprotein, G）和依赖RNA的RNA 多聚酶（RNA dependent RNA polymerase or Large protein ， L ）。病毒颗粒由囊膜（ Envelope ） 和核衣壳（Nucleocapsid）两部分组成，基因组RNA 及外层紧密盘绕的N、P、L 蛋白共同构成具有转录、翻译功能的核衣壳；颗粒外层脂质膜表面镶嵌着G 蛋白以三聚体构成的纤突（Spike），为病毒中和抗原及与宿主受体结合的部位，M 蛋白位于外壳内侧和核衣壳之间，连接内外两部分[1, 2]。

狂犬病病毒不耐高温，悬液中的病毒经56℃ 30-60 分钟或100℃ 2 分钟即失去感染力。脑组织内的狂犬病病毒在常温、自溶条件下，可保持活力7-10 天，4℃可保存2-3 周。狂犬病病毒在pH 7.2-8.0 较为稳定，超过pH 8 易被灭活。狂犬病病毒对脂溶剂（肥皂水、氯仿、丙酮等）、乙醇、过氧化氢、高锰酸钾、碘制剂以及季铵类化合物（如苯扎溴铵）等敏感[3]。1:500 稀释的季胺类消毒剂、45%-70%乙醇、1%肥皂水以及5%-7%碘溶液均可在1 分钟内灭活病毒，但不易被来苏水溶液灭活[4, 5]。

不同型别狂犬病病毒的致病性不同：在犬、猫等哺乳动物中传播，也称“街毒”的狂犬病病毒毒力很强，感染后一旦出现临床症状，病死率几乎100%，是世界上病死率更高的传染病；而在蝙蝠中传播的狂犬病病毒毒力相对较弱。

直到20 世纪50 年代，RABV 一直被认为是狂犬病的唯一病原[6]。通过对来自尼日利亚的与RABV 有血清学相关性的病毒即LBV（Lagos bat virus）和MOKV（Mokola virus）的鉴定，以及对1970 年分离自南非被蝙蝠咬伤病人的DUVV（Duvenhage virus）病毒的分析，发现了狂犬病病毒群的复杂性，由此出现了“狂犬病相关病毒（Rabies-related virus）”和“狂犬病血清型”的术语，目前分别将RABV、LBV、MOKV、DUVV 确定为四种血清型。

1950 年以来在欧洲分离到的蝙蝠病毒与DUVV 呈血清学相关性，应用单克隆抗体反应将欧洲蝙蝠病毒进一步分为EBLV-1（European bat lyssavirus 1）和EBLV-2（European batlyssavirus 2）。针对狂犬病相关病毒多样性的遗传进化研究，产生了新的专业术语“基因型”，并继续发现了新的基因型，如1997 年从澳大利亚果蝠中分离到的ABLV（Australian batlyssavirus）确定为基因7 型。为了更好地对日益增多的狂犬病相关病毒进行归类，国际病毒分类委员会（International Committee of Taxonomy Virus, ICTV）主持设立了狂犬病病毒属，将现存的基因型作为狂犬病病毒分类的基础，并结合系统发生进化树的拓扑结构、单克隆抗体反应谱，以及生态、宿主、地理范围等特征确立了病毒种类。

2014 年，ICTV 最新分类结果明确了14 种（Species）狂犬病病毒。除了上述7 个基因型代表7 种不同的狂犬病病毒外，21 世纪新发现的另外7 种病毒包括从中亚食虫蝙蝠中分离到的KHUV（Khujand virus）和ARAV（Aravan virus），从俄罗斯食虫蝙蝠中分离到的IRKV（Irkut virus）和WCBV（West Caucasian bat virus），从非洲肯尼亚食虫蝙蝠中分离到的SHIBV（Shimoni bat virus），从法国、德国食虫蝙蝠中分离到的BBLV（Bokeloh bat lyssavirus）和坦桑尼亚非洲灵猫身上分离到的IKOV（Ikoma lyssavirus）[7]。2011 年从西班牙蝙蝠中分离到的LLEBV（Lleida bat lyssavirus）尚未经

ICTV 明确归类[1] 。

（二）实验室诊断

标本采集：病人发病后（死亡前）可采集其唾液（间隔3-6 小时，至少采集3 份）、脑脊液、血清及颈后带毛囊的小块皮肤；病人死后更好采集其脑组织标本（小脑和脑干）进行实验室检测[6, 8]。

直接免疫荧光法（Direct Fluorescent Antibody Test, DFA）是狂犬病诊断的金标准，可以快速、敏感、特异地检测人和动物脑组织中的病毒抗原[6, 9]。临床病例活体组织标本（如颈后部皮肤毛囊）亦可进行DFA 检测[6]。直接快速免疫组化法（Direct Rapid Immunohistochemical Test, DRIT）及酶联免疫吸附测定法（Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay,ELISA）亦可特异检测狂犬病病毒抗原[6] 。

病毒核酸检测可用于早期诊断，以逆转录PCR 法（ReversTranscription-PCR, RT-PCR）（包括Real-time RT-PCR）检测体液（唾液、血清等）和脑组织等标本，但需要严格的质量控制以保证结果的准确性[6, 9]。脑组织及唾

液等病毒含量高的样本还可进行病毒分离。细胞培养分离所需时间（1-2 天）远少于小鼠颅内接种分离法所需时间（10-21天）[6, 9]，且前者的生物安全风险远小于后者。

未接种过疫苗的患者，发病早期几乎没有中和抗体产生，到发病晚期（通常在临床症状出现后7-8 天），病毒在脑内大量增殖后突破血脑屏障进入血液， *** 机体产生低水平的中和抗体。通过病毒中和试验检测病人血清或脑脊液中的中和抗体，可作为狂犬病诊断的依据之一[3, 6, 9]。

世界卫生组织（World Health Organization, WHO）推荐的抗狂犬病病毒中和抗体标准检测方法包括快速荧光灶抑制试验（Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test，RFFIT）和小鼠脑内中和试验（Mouse Neutralization Test，MNT）[3, 9]。由于RFFIT 法无需使用小鼠，所用时间短（24 小时），目前已被广泛采用。RFFIT 方法也是我国现行药典规定的检测狂犬病病毒中和抗体的标准方法之一。此外，常用的狂犬病病毒中和抗体检测方法还有荧光抗体病毒中和试验（Fluorescent AntibodyVirus Neutralization Test, FAVNT）如果需要检测可以关注公众号paidichang咨询检测中和抗体[6] 。

用ELISA 法测定的抗狂犬病病毒糖蛋白抗体滴度与用病毒中和试验测定的结果有一定的相关性（约80%符合率），但相应试剂盒尚未普及[3, 6]。

此外，还可以通过检测中和抗体，监测暴露前抗体背景及暴露后疫苗注射的免疫效果。WHO 狂犬病专家咨询委员会认为：中和抗体水平等于或高于0.5IU/ml 时，接种者才具备了有效的保护能力；如果发现中和抗体水平低于0.5IU/ml，应进行加强免疫，至达到有效保护水平为止[3, 6]。

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